中华耳科学杂志,年19卷2期
斑马鱼模型评价抗真菌药物的耳毒性
谌晶晶徐慧芳唐旭霞
真菌性外耳道炎是真菌感染外耳道皮肤所致的炎性病变，多局限在外耳道，但也可通过穿孔的鼓膜侵及中耳或开放的乳突腔。其症状常表现为耳道瘙痒、溢液、耳胀及听力下降等。最常见的致病菌是白色念珠菌和曲霉菌[1-3]。
真菌性外耳道炎的治疗除清洁外耳道，保持外耳道干燥外，局部抗真菌药物的使用也很重要。氟康唑、联苯苄唑及制霉菌素这三种抗真菌药在临床工作中使用率较高。氟康唑和联苯苄唑属于唑类抗真菌药，制霉菌素属于多烯类抗真菌药，两者均有广谱抗菌作用。前者通过阻断麦角甾醇的合成而破坏真菌细胞壁的完整性，抑制真菌的生长繁殖，后者通过改变真菌细胞壁通透性发挥作用。局部用抗真菌药剂型主要有软膏、凝胶、乳膏和水剂。有研究显示软膏可能刺激中耳黏膜形成肉芽。相比其他剂型，水剂更容易到达外耳道深部，特别是在外耳道充血肿胀的情况下。因此，水剂更适合真菌性外耳道炎。但在鼓膜置管、鼓膜穿孔及实施过乳突开放术的情况下，滴耳液就有可能进入中耳，进而通过圆窗膜进入内耳，对内耳毛细胞的功能造成不同程度的影响[4-6]。因此，对抗真菌药物耳毒性的研究非常必要。
斑马鱼为低等脊椎动物，其产卵量大，繁殖周期短，胚胎身体透明，可以在显微镜下观察其给药前后组织器官的变化情况。因而，近年来，斑马鱼被广泛应用于药物的药理及毒性研究[7，8]。斑马鱼虽然没有外耳及中耳，但具有典型的内耳结构，其内耳毛细胞及分布在身体侧线神经丘上的毛细胞在功能和形态上与哺乳动物内耳毛细胞极为相似[9]。通过特异的免疫荧光染色，能很好的观察药物对毛细胞的影响。本实验将利用斑马鱼来研究氟康唑、联苯苄唑、制霉菌素的耳毒性，以期建立一种简便、灵敏、快速、直观地检测抗真菌药物耳毒性的斑马鱼模型和方法。
1实验材料和方法
1.1实验材料
1.1.1实验动物
斑马鱼胚胎的繁殖以自然成对交配的方式进行。每次交配准备4~5对成年，AB品系斑马鱼，平均每对能产~个胚胎。在受精后6小时（即6hpf）和24hpf对胚胎进行清理（移除已死亡胚胎），并根据胚胎的发育阶段挑选合适的胚胎。在28℃条件下用养鱼用水孵育胚胎（养鱼用水水质：每1L反渗透水中加入mg速溶海盐，电导率为~μS/cm；pH为6.9~7.2；硬度为53.7~71.6mg/LCaCO3）。
1.1.2实验用药，仪器与试剂
氟康唑(批号A)、联苯苄唑（批号）、制霉菌素（批号L1124）及庆大霉素（阿拉丁，批号）用0.1%的二甲基亚砜（DMSO）分别配制成储备液，-20℃保存储备液，实验前根据所需浓度进行稀释。
荧光立体显微镜（NikonAZ,Japan）；解剖显微镜(OlympusSZX7,Japan)；6孔板（NestBiotech）；二甲基亚砜（DMSO，阿拉丁，批号）；DASPEI染料（sigma，批号k）。
1.2实验方法1.2.1确定三种药物的最大非致死浓度（MNLC）及10%的致死浓度（LC10）
三种药物的初始检测浓度均设计为0.1，1，10，和μg/mL。分别用上述浓度各处理30尾6hpf（受精后6小时）的斑马鱼至5dpf（受精后5天），每天更换药水并清除死亡斑马鱼。最后，统计每种药物不同浓度下6hpf至5dpf斑马鱼总的死亡数量，使用统计学软件GraphPadPrism6.0绘制最佳的浓度效应曲线，经过曲线拟合，分别计算出三种药物的MNLC和LC10。如果上述初始检测浓度无法得出MNLC及LC10，则进一步测试药物浓度低至0.01μg/mL或高至0μg/mL。
1.2.2评价药物的耳毒性
实验组：每种药物选取4个浓度进行检测（LC10、MNLC、1/3MNLC和1/10MNLC）；阳性对照组（庆大霉素组）：5μg/ml的庆大霉素；阴性对照组：养鱼用水；溶剂组：0.1%DMSO[10]。各组均处理30尾6hpf的斑马鱼至5dpf。
（1）分别于3dpf和5dpf在显微镜下观察斑马鱼平衡囊及躯干形态的变化，拍照并保存。
（2）用毛细胞特异性荧光染料DASPEI对5dpf的斑马鱼进行染色。每组随机选择10尾斑马鱼，在荧光显微镜下观察斑马鱼侧线神经丘及头部5个神经丘(O1,O4,MI1,MI2,IO4)毛细胞的分布和排列，用图像处理软件进行图像分析，一方面计算毛细胞荧光强度（S），另一方面数出头部5个神经丘的毛细胞数量。
1.3统计学方法
斑马鱼的毛细胞损伤率计算公式如下：毛细胞损伤率（%）=（S(溶剂组)-S（化合物组））/S（溶剂组）×%采用单因素方差分析及Dunnett’sT检验比较各组间的差异。P0.05为差异具有统计学意义。
2结果
2.1MNLC和LC10
三种药物的初始测试浓度及斑马鱼死亡率见表1，通过表1中的药物浓度拟合出最佳浓度效应曲线（R2＞0.99），如图1，得出药物的MNLC和LC10。氟康唑、联苯苄唑、制霉菌素的MNLC分别为.8μg/mL,0.37μg/mL和10.5μg/mL，LC10分别为.4μg/mL,0.52μg/mL和11.8μg/mL。
2.2平衡囊及躯干形态的变化
三种抗真菌药及庆大霉素组均出现明显的斑马鱼耳毒性，表现为球囊和椭圆囊大小、形态发生改变，躯干屈曲（见图2，图3）。
2.3毛细胞的变化
根据斑马鱼侧线神经丘及平衡囊周围神经丘（O1,O4,MI1,MI2,IO4）的免疫荧光强度，可计算出毛细胞的损伤率，如表2。与阴性对照组比较，庆大霉素组及三种抗真菌药物组斑马鱼毛细胞的荧光强度均减弱，差异具有统计学意义，P0.。
为进一步分析抗真菌药物对毛细胞的影响，数出着色的神经丘O1,O4,MI1,MI2,IO4毛细胞数量，与阴性对照组比较。结果显示每个神经丘毛细胞数量均减少，差异具有统计学意义，如图4。
3讨论
5年，Ton等提出药物的斑马鱼耳毒性与对人内耳的毒性存在相关性[11]。利用斑马鱼来研究氨基糖甙类抗生素及抗肿瘤药物顺铂等耳毒性的实验证明斑马鱼是良好的筛查药物耳毒性的模型[12-16]。8年，Chiu等使用斑马鱼模型筛查了FDA批准使用的种药物，发现21种药物具有斑马鱼耳毒性，其中2种药物的毒性作用在进一步的大鼠实验中得到确认[9]。证明了斑马鱼在筛查药物耳毒性方面的价值。年，学者Schuknechtin首次提出滴耳液可能存在耳毒性[17]。随后，使用滴耳液导致听力损失的病例时有报导，相关药物的耳毒性研究也越来越多[18-20]。
本研究对临床中常用的三种抗真菌药物-氟康唑、联苯苄唑、制霉菌素-进行耳毒性的筛查,发现三种药物均具有斑马鱼耳毒性，并且存在剂量依赖关系，包括改变球囊、椭圆囊的大小，神经丘毛细胞数量减少，斑马鱼身体侧翻。身体的屈曲及侧翻可能跟平衡囊毛细胞受到损伤进而影响其功能相关。
该模型可快速、灵敏地筛查出抗真菌药物的耳毒性。本实验中联苯苄唑的致死浓度最低，氟康唑的致死浓度最大，说明即使同属于唑类抗真菌药，造成斑马鱼毒性作用的药物浓度也是不一样的。回顾文献，尚无利用斑马鱼来研究上述三种抗真菌药物耳毒性的实验。少量抗真菌药物耳毒性的实验则是使用哺乳动物。TomLW利用豚鼠对克霉唑、咪康唑、制霉菌素耳毒性的研究示该三种抗真菌药处理后豚鼠耳蜗毛细胞数量并无减少[21]。Süleyman?zdemir利用白鼠对奥西康唑耳毒性的研究示奥西康唑处理后白鼠的畸变产物耳声发射（DPOAE）幅度并无改变[2]。TomLW的研究使用电镜直接观察毛细胞数量的改变，与本研究有相似之处，克霉唑、咪康唑与氟康唑、联苯苄唑同属唑类抗真菌药，但TomLW等发现豚鼠的毛细胞数量并无减少，而本实验中氟康唑、联苯苄唑处理后的斑马鱼毛细胞均有不同程度的减少。可能原因是1.实验所用药物浓度不一样，本研究中选用1/10MNLC,1/3MNLC,MNLC和LC10的药物浓度，而TomLW的研究直接选用1%的克霉唑水剂和2%的咪康唑乳膏；2.药物进入内耳的途径不一样，豚鼠属哺乳动物，有外耳、中耳及内耳，药物需经过中耳渗透进入内耳，而斑马鱼无中耳结构，药物直接从表皮渗透进入内耳。奥西康唑也属于唑类抗真菌药，Süleyman?zdemir等的研究证明奥西康唑对白鼠无耳毒性，但所采用的评估方式是对比DPOAE幅度的改变。DPOAE幅度无改变说明药物对毛细胞整体的功能无影响，而是否造成了毛细胞显微结构的损伤或坏死未可知。
尽管本实验结果显示氟康唑、联苯苄唑及制霉菌素均具有斑马鱼耳毒性，但并不能直接证明其对人耳具有毒性作用。原因有以下几方面：1.滴耳液通常用于处于炎症状态的皮肤、黏膜，炎症导致的中耳黏膜水肿、渗出，甚至脓性分泌物均能阻挡药物进入内耳[22]；2.正常中耳黏膜非常薄，而炎症状态的黏膜较厚，降低了黏膜的渗透性，从而减少药物的渗入[23]；3.斑马鱼无外耳和中耳，缺少中耳黏膜的阻挡。另外，斑马鱼属于脊椎动物，药物的代谢过程不同于哺乳动物，并且斑马鱼的毛细胞能在药物去除后再生，药物还可通过斑马鱼皮肤、吞咽等吸收进入体内[11]。因此，进一步在哺乳动物体内的研究非常必要。
不足之处：本文侧重形态学，没有电生理学研究资料，稍显不足；其次，本研究仅初步探索了三种抗真菌药物的耳毒性现象，而未对其导致毛细胞损害的机制进行深入的研究。在接下去的实验中，我们将进一步进行机制研究。
4结论
1.三种抗真菌药物均具有斑马鱼耳毒性，导致斑马鱼平衡囊躯干形态发生改变，均导致斑马鱼毛细胞数量的减少，并存在剂量依赖关系。2.本实验通过研究制霉菌素、氟康唑、联苯苄唑对斑马鱼幼体毛细胞的损伤作用，建立了一种简便、灵敏、快速、直观地检测抗真菌药物耳毒性的斑马鱼模型和方法。
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