斑马鱼HSPCs扩增的动态单细胞发育图谱 [复制链接]

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科学家们使用单细胞RNA测序(ScRNA测序)来绘制28，个细胞的转录谱，这些细胞是从跨越三个连续发育阶段的CHT中挑选出来的。利用这些图谱，表征了HSPC转录异质性，并确定了一种内皮特异性调节因子——G蛋白偶联受体(Gpr)，以细胞类型和阶段特异性的方式在功能上支持HSPC扩增。对斑马鱼CHT和人类FL的跨物种分析揭示了进化过程中保守的细胞成分和转录程序。该研究描绘了扩增性造血组织的动态单细胞发育图谱，深入解析了造血干细胞扩增的细胞基础和分子机制，为体外HSPC扩张提供了潜在的线索。

文章引言：

在脊椎动物中，胚胎发生过程中产生的最早确定的造血干祖细胞(HSPCs)。而HSPCs为了建立HSPC池，新生的造血干细胞将首先迁移到一个短暂的造血器官，称为胎肝(哺乳动物中的FL)或尾部造血组织(斑马鱼中的CHT)。临床上，体外HSPC扩展是获得足够的可移植HSPC的可行方法，但在技术上仍然具有挑战性。因此，解码造血器官内HSPC扩增的复杂调节机制是至关重要的。斑马鱼CHT是一个高度血管化的生态位，快速增加的血管内皮细胞(ECs)形成一个复杂的结构，构成背动脉和蜂窝状静脉网络。然而全部niche组件如何协调HSPC的发展仍未知。课题组前期已利用多维多重转录组技术，系统阐释了造血干细胞和微环境细胞之间的分子调控网络。然而，对造血干细胞扩增和分化的时间区段内，血管微环境的细胞复杂性、功能可塑性及动态协同发育过程的研究十分有限。

文章结果：

图1：发育中的斑马鱼CHT单细胞转录组图谱。选择斑马鱼CHT三个HSPC发育的重要时间点55hpf、3.5dpf、4.5dpf进行单细胞RNA测序，对斑马鱼尾部造血组织CHT进行分析，分选内皮细胞（ECs）、造血干细胞（HCs）、神经细胞（NCs）。随后主要对9种细胞类型（造血干细胞、红细胞、骨髓细胞、内皮细胞、神经细胞、上皮细胞、表皮细胞、成纤维、肌肉细胞）进行分群与鉴定标记。

图2：CHT发育过程中的细胞组成和基因动态表达。对来自三个时间段的细胞图谱进行综合分析，发现HPSC成分的比例是动态变化的，DEGs分析揭示了造血和niche细胞在不同发育阶段的不同点：比如55hpf，高表达的tal1和smarce1与mRNA加工有关；3.5dpf高表达的bcl11ba和cebpb与翻译相关，4.5dpf高表达的her6与红细胞分化、骨髓细胞分化相关。2C图则显示了HSPCs和niche细胞一些相关基因的表达有着相似性，说明niche细胞协同HSPCs发育。

图3：谱系启动和代谢基因信号的HSPC异质性。GO和DEGs转录组分析表明了HSPC亚群1、2、3和4具有不同差异的转录基因，说明不同的亚群具有不同的功能，随后用轨迹模型来模拟HPSC不同亚群的分化路线，55hpf时HPSC1的高比例是为了满足CHT对造血分化的需求；在3.5dpf和4.5dpf中，HPSC1的比例降低，而HPSC2、3、4比例在分化过程中逐渐增加说明了HPSC的异质性水平和发育时间点相关。3F和G图的代谢转录组分析也显示了HPSC的异质性和不同亚群细胞的不同功能有关。

图4：造血干细胞和非造血niche成分之间的细胞间相互作用网络。为了解释非造血niche成分（内皮细胞、神经细胞、上皮细胞、表皮、肌肉细胞和成纤维细胞）对HPSC扩增的调节机制，建立了一个遗传网络，分析了个差异表达的转录因子和HPSC之间的互作关系，随后用KEGG通路富集分析了CHT的HPSC表达的受体和niche细胞表达的配体之间的相互作用，发现了文献报道的ccl25b-ccr9a在类内皮细胞和造血干细胞之间的相互作用已经被证明是CHT的HSPC扩增所必须的，同时还预测了两个新的配体受体对：内皮细胞和HSPC之间的dll4-notch2、成纤维细胞和HSPC之间的ptprr-fgfr2都是HSPC扩增所必须的。

图5：确定HSPC扩增的关键niche因子——Gpr。非特异性G蛋白受体编码基因Gpr，以前被称为肾上腺髓质素受体，已有文献报导Gpr调节HPSC生成和骨髓细胞分化，但是尚不清楚Gpr是否以及如何参与了CHT的HPSC的扩增。5C图Gpr在2dpf和4dpf中的表达水平差不多，用MO来抑制Gpr在斑马鱼中的表达，发现Gpr-MO组和NC组的CVP(尾静脉丛)结构和ECs数量是正常的，但是免疫荧光和流式分析显示了在3dpf时HPSCs的数量减少，表明在CHT的HPSC发育过程中，Gpr具有不可或缺的功能。

图6：小鼠FL中的HSPC扩增需要Gpr。用单细胞测序数据和q-PCR分析了Gpr在小鼠FL中的表达情况，发现Gpr在小鼠FL内皮细胞中高度富集，随后用小鼠胚胎发育E14.5天分离出HPSC与Gpr-siRNA与共培养进行CFU-C分析，发现si-Gpr可以降低造血干细胞的扩增能力，再次证明了Gpr对脊柱动物HPSC扩增的调节机制。

图7：人类FL和斑马鱼CHT之间的跨物种分析。通过将斑马鱼尾部造血组织和人胎肝的单细胞数据进行比对分析，研究人员发现二者在进化上具有保守的细胞类群基因表达，而其差异性则体现在细胞类型组成和HSPC的转录组特征，即：斑马鱼的扩增性造血组织的HSPC更能适应温度变化，人胎肝中的HSPC具有更强的免疫特征。上述结果暗示了造血干细胞对环境的适性进化。

文章结论：

该研究建立了斑马鱼CHT的HSPC扩增的单细胞转录图谱，为理解HSPC在niche中的扩增和分化的调控机制提供了必要的资源。重要的是，揭示人类胎肝组织和斑马鱼CHT之间的保守性和差异，揭示HSPC扩展的潜在关键因素-Gpr，有助于改进HSPC体外扩增的实验方案。